对单个人类细胞的基因组进行准确的变异检测和大范围单倍体型分析一直以来都是测序领域的巅峰挑战。单细胞测序使我们能在更高的分辨率下研究生命的机制。一方面，在像癌症这样的组织样本中存在大量具有不同基因组类型的单个细胞,因此需要分析单细胞水平基因组而不是大量细胞的平均值；另一方面，对于非常珍贵的细胞样品，如人类卵母细胞和循环肿瘤细胞（CTCs），单细胞测序具有无与伦比的优势；此外，利用单细胞测序，还可以揭示细胞个体在特定时间的演化情况。

正常人类单个细胞DNA含量为6.6pg，相对于测序所需的ug级相当微量，并且独一无二，“有些DNA一旦错过就不再”！因此单细胞测序的关键一环是全基因组扩增(WGA)，常见的方法如，DOP-PCR、MDA、MALBAC等需要用DNA聚合酶对细胞基因组做大量的体外扩增，然后构建文库进行相对读长较短的高通量测序。这些方法有两个明显的缺点：1，聚合酶的错误扩增可以在基因组上产生成千上万的假阳性。2，短的序列读长几乎不包含任何单倍体类型信息。

面对这些问题，有没有更好的解决办法呢？

张鹍教授的团队近期在PNAS发表题为“Ultra-accurate Genome Sequencing andHaplotyping of Single Human Cells”文章给出了解决方案。研究人员开发了一个名为“SISSOR” (微流体反应器法单链测序)的方法，用来进行准确的单细胞基因组测序和单倍体分型。

该方法是利用微流体处理器将单个细胞染色体DNA的正负双链进行分离，并将百万碱基大小的DNA片段随机分割成大量的纳升级的组分，用于扩增和构建测序文库，从而实现对同源染色体的互补双链分别进行独立的测序。这样就能够进行Long-range单倍体的组装，并且还能利用冗余和单倍体型信息纠正测序错误。据文章结果显示，该方法的纠错能力可以将单细胞测序错误率降低至10-8，并且单倍体片段平均可组装长度为500kb，重叠群contig达到N50大于7 Mb。该方法性能可以进一步提高，使其扩增更均匀和比对更精确，能够获得精准的单细胞基因组序列以及单倍体信息以满足临床对基因组测序的不同需求。

张鹍教授

微流体反应器

微流体反应器应用于单细胞测序其实早有应用，黄岩谊和谢晓亮教授为了精确检测基因组变异，在2015年报道的emulsion WGA (eWGA)技术即是“emulsion+MDA+microfluidic Chip”的三位一体的结合，无论是扩增的均匀性、基因组的覆盖度还是假阳性的比例都有明显的改善。如果说eWGA是单细胞测序的“CPU 1.0”，那么张鹍教授的方法进行了巧妙的改进，将其升级到了2.0时代。

2.0的显著的改进可以归纳为两点：

1，基因组DNA变性成单链，并且是Mb级大片段；

2，将大片段通过均匀分布到24个独立的反应小室中，分别扩增建库。这好比是做拼图游戏，将整个240块图形，先区分成24个区域，每个区域做10个图形的拼凑，大大降低了组装难度，并且Mb级别的大片段包含了大量单倍体型的信息；另外独立小室的MDA反应体系更接近单分子扩增，同于eWGA的效果，能使扩增均匀性得到大大提升。

图: eWGA：在一个试管中，裂解单个细胞，然后与MDA反应缓冲液混合。用于微流体交叉连接装置的乳化生成均匀分布的微滴，进行DNA片段扩增（来源文献3）。

图: SISSOR技术：单细胞捕获，进行裂解，染色体DNA分子以KOH溶液(ALS)分离成单链形态。单股DNA分子在24个小室随机分布。每个小室都被放入MDA反应室。每小室里的扩增分别收集出来，然后加工成单独barcode的测序文库。

研究人员使用SISSOR技术对人的PGP1纤维细胞系进行了实测，结果显示：

1.单倍体组装：通过将所有reads比对到参考基因组序列，能够达到预期的将Mb级DNA片段可视化的呈现，并且能够将两条同源的姐妹单体上四条互补链区分开来。

2.提高测序精度：基于SISSOR的单链独立小室的实验基础，可以通过比较不同小室的单链碎片的单倍体类型来确定互补链，并将不同小室的同源序列相互匹配来纠正测序错误比率。

论文通讯作者张鹍教授表示，SISSOR是对单细胞测序技术的一次突破，将测序准确性提高了两个数量级。

对于SISSOR技术的应用前景，张鹍教授介绍道：“这项技术潜在的应用包括对患者血液中循环肿瘤细胞进行准确的检测，以及对体外受精的健康胚胎进行筛选，此外，利用该技术可以对经过基因组编辑的人体细胞进行检测，以达到治疗的目的。”

随着前不久“人类细胞图谱”计划的开展，单细胞测序的研究热情必然持续高涨，SISSOR技术凭着其独特的单倍体型分析优势，和超高的测序精度必然将成为人们争相使用的技术。希望通过不断的完善，为科研和临床做出更大贡献。

参考文献：

1.Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology andApplications.

2.Ultra-accurateGenome Sequencing and Haplotyping of Single Human Cells.

3.Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genomeamplification.

本周科研进展

1.美国时间10月25日，知名华人学者张锋教授的团队在Scinece上在线发表了一篇重磅论文——带来一款全新CRISPR系统“REPAIR”，能有效地对RNA中的腺嘌呤（A）进行单碱基编辑。有望在不修改基因组的前提下，精准地矫正致病的遗传突变。

2.美国时间10约5日，由麻省理工学院广泛研究所和马萨诸塞州剑桥的哈佛分校David Liu教授实验室主导开发的新基因编辑系统——腺嘌呤碱基编辑器（ABE），在Nature发表，改系统能将A-T碱基对转换为G-C碱基对。

3.美国10月23日，Nature和Nature Genetics期刊同期发表了两篇论文，介绍了与乳腺癌风险上升相关的遗传变异，27.5万人研究揭示多个全新乳腺癌风险位点，这将有利于改进乳腺癌的早期筛选和检测方法，并可能为新药物的研发提供思路。

4. 10月23日，中国科学院动物研究所赵建国研究团队通过新一代基因编辑工具CRISPR，向猪细胞内插入一种叫解偶联蛋白1（UCP1）的基因，减少脂肪沉积，增加瘦肉率，最终培育出的猪比正常猪脂肪少24％。

5.最近，东南大学生物科学与医学工程学院博士常宁率领着一支十多人的科研团队MxHealth突破癌症早期检测难关。他们的专利技术通过一滴血就可筛检12项早期癌症，像查血常规、血压血糖一样方便快捷。

6.近日发表在Cell的研究中，英国维康基金会桑格研究所的科学家们首次对29种癌症类型的7,500多例肿瘤进行了研究，给出了对癌症发展所需突变次数的估计。研究所及其合作者利用来自进化领域的技术，发现细胞中平均需要1至10个突变才能驱动癌症。癌症类型不同，驱动癌症的突变数量也有很大差异。

6.近日，Timothy Lu教授在Cell杂志发文，提出了基因电路理论，设计了用于癌症免疫治疗、基于合成RNA的免疫调节基因电路。该设计能带动更多的免疫调节剂，有可能治疗其他癌症，以及其他需要精准的免疫治疗的疾病。

7.英国研究团队在近日《自然》杂志上撰文指出，他们借助一种全新方法，利用小鼠发育最初期的4~8个细胞胚胎，培育出了一种全能干细胞系——扩展潜能干细胞（EPSCs）。新细胞不仅能发育成任何类型的细胞，且发育潜力超过胚胎干细胞等，有望为研究治疗流产和发育紊乱问题开辟新方向。

8.近日，Nature Communications杂志上的一项研究发表了一种此前在动物机体中功能尚未明确的DNA修饰：A（腺嘌呤）甲基化。研究人员认为，在压力条件下大脑似乎更容易出现这种腺嘌呤甲基化，并且可能在神经精神疾病中扮演者重要角色。

9.日前，发表在Science杂志上的一篇新论文中，来自哈佛医学院的科学家们证实，一种被称为“氨”的细胞代谢废弃副产物能够被癌细胞巧妙地重新利用，帮助其生长。研究者们认为，这项成果有望帮助设计新的抗癌疗法。